High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Disusun oleh:
Idha Zuly Astutik 4301411008
Febilia Dhita Serfanda 4301411022
Ifan Shovi 4301411041

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2013

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), dalam bidang kefarmasian yaitu HPLC Method for the Analysis of Paracetamol, Cafeine and Dipyrone (Metode HPLC Untuk Analisis Parasetamol, Kafein dan Antalgin).
HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair – cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid Chromatography.
Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
Teknik Pemisahan dengan HPLC
Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam.
Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai. Selain dari beberapa factor ini, hal utama yang harus diperhatikan adalah pengetahuan yang baik mengenai HPLC serta pengalaman dan keterampilan kerja yang baik. Pelarut yang digunakan dialirkan terus menerus secara kontinyu ke dalam pompa.
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10.
Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya
kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0. Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detector sebagai kordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel (Ahmad dan Suherman, 1991).
Berikut dapat dilihat susunan peralatan HPLC, yaitu :
1. Tempat peletakan fasa gerak (reservoir)
Pada tempat fasa gerak kebersihannya harus terjaga, agar tidak ada zat-zat pengotor yang dapat mengotori pelarut. Fasa gerak (pelarut) bermacam-macam kepolaritasannya. Sebab diharapkan agar komponen yang akan dipisahkan memiliki sifat yang sama dengan pelarut, sehingga zat tersebut dapat terpisahkan.
2. Pompa
Untuk mengalirkan fasa gerak digunakan pompa, yang akan mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem. Pompa yang baik adalah pompa yang dapat memompakan fasa gerak secara konstan, memiliki batas tekanan maksimal yang cukup tinggi (3000-6000 Ф), tidak mengandung bahan yang reaktif terhadap pelarut, cara kerjanya sederhana, mempunyai noise yang rendah, dan mempunyai fluktasi tekanan minimal.
3. Injector
Ketepatan jumlah volume yang diijeksikan sangat penting untuk analisi kuantitatif. Oleh karena itu, tipe injector yang digunakan pada HPLC adalah injector dengan pipa dosis. Suatu injector dikatakan baik apabila memiliki keberulangan yang tinggi, mudah digunakan, dan dapat digunakan pada keadaan dimana tekanan balik pada kolom relative lebih tinggi.
Agar injector tetap awet, maka setiap selesai analisa injector dicuci dengan menggunakan pelarut (fasa gerak) yang digunakan, dan jangan mengganti posisi injector dengan posisi load ke posisi injek karena dapat menyebabkan seal pada injector cepatrusak atau aus.
4. Kolom
Kolom merupakan area terjadinya pemisahan komponen-komponen yang dianalisa. Sama halnya dengan injector, setelah menganalisa kolom harus dicuci, dan direndam dalam pelarut organic yang sesuai. Jika fasa gerak yang digunakan diganti dengan yang kepolaritasannya berbeda maka harus menggunakan pelarut perantara dalam kolom tersebut. Laju alir pelarut pun perlu diperhatikan, sebab jika laju alirnya tinggi dapat menyebabkan kolom rusak atau tersumbat.
5. Detektor
Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan.
Suatu detector harus memiliki kepekaan tinggi; limit deteksi kecil; noise rendah, stabil dan mempunyai keberulangan naik; tidak terpengaruh oleh perubahan suhu, dan yang terpenting memberikan respon terhadap bermacam-macam jenis senyawa.
6. Recorder
Recorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu oleh noise listrik.
Secara sederhana, desain alat HPLC (HPLC) dapat ditunjukkan pada gambar berikut.
Pada penggunaannya, eluen yang akan digunakan dialirkan dengan pump A dan pump B dengan perbandingan volume yang dikontrol melalui monitor. Pelarut-pelarut tersebut akan melalui degassit untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara dalam pelarut tersebut. Sampel yang ingin dianalisis diinjeksikan melalui injektor dan akan bercampur dengan eluen
didalam mixer yang selanjutnya akan mengalir menuju kolom untuk dilakukan pemisahan. Out put data akan ditampilkan pada monitor, baik berupa data kualitatif mupun kuantitatif.
Data kualitatif diperoleh dalam bentuk spktrum dengan cara membandingkan dengan spktrum standar sehingga dapat diidentifikasi suatu zat atau senyawa. Sedangkan data kuantitatif langsung ditunjukkan pada layar berupa kadar atau konsentrasi suatu zat yang ingin ditentukan
Kelebihan HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
b. Mudah melaksanakannya
c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
e. Resolusi yang baik
f. Dapat digunakan bermacam-macam detektor
g. Kolom dapat digunakan kembali
h. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
i. Banyak pilihan fasa geraknya
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
Prinsip Kerja Dari HPLC
Adapun prinsip kerja dari HPLC adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
Kegunaan HPLC
Kegunaan umum HPLC adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. HPLC merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Mekanisme Kerja HPLC
Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen HPLC pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam
1. Wadah fase gerak pada HPLC
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk HPLC berderajat HPLC (HPLC grade).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam pemilihan fase gerak.
Beberapa deret eluotropik HPLC :
Pelarut
Parameter kekuatan pelarut (adsorbsi)
Parameter kekuatan pelarut (partisi)
UV cut off (nm)
n-heksana
0,01
0,1
195
Sikloheksana
0,04
-0,2
200
Tetraklorometan
0,18
1,6
265
Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm, pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.
3. Pompa
Syarat pompa yang digunakan adalah : harus inert terhadap fase gerak.Bahan yang umumnya dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis pompa HPLC yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
4. Injektor (penyuntikan sampel)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada HPLC.
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter
Kolom konvensional
Kolom mikrobor
Tabung kolom
Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm
Stainless steel
Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 atau 2 mm
Fase diam
Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10μm dengan kisaran sempit.
Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10μm dengan kisaran sempit.
Tekanan operasional
500-3000 psi
(35-215 bar
1000-5000 psi
(70-350 bar)
Fase gerak
Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir : 1-3 ml/menit
Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100 μl/menit.Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah 10μl/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume kecil.
Kinerja
Efisiensi meningkat dengan bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 μm lebih pendek.
Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 μl/menit)
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus
trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam <1ppm)
7. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Jenis – jenis detector
 SpektrofotometerUV –Visible
 Indeks bias
 Spektrofluorimeter( zatberfluoresensi)
 Konduktivitaslistrik( zationik)
 Spektrometerinfra merah
 Spektrometermassa( LC –MS )
 SpektrometerNMR ( LC –NMR )
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8μl atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 μl atau lebih kecil lagi.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Penggunaan HPLC dalam bidang farmasi
Metode HPLC merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan HPLC
merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa contoh penggunaan HPLC untuk analisis beberapa sediaan farmasi :
Obat (sediaan)
Fase diam
Fase gerak
Detektor
Adriamisin (serum)
C18
Asetonitril-asam fosfat 0,01 N ph 2,3 (50:50)
Fluoresen
EK : 465 nm
EM : 580 nm
Aktinomisin (Serbuk)
C18
CH3CN-H2O (1:1)
Elektrometer
Allopurinol (tablet)
C18; 4 x 30 cm
KH2PO4 0,05M; 1,5 ml/menit
UV 254 nm
APLIKASI HPLC
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
1) HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2) Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4) Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.
. 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Putra, Effendy D. L., 2004. ’Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi’ J. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3-6.
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
http://tjahkimiaunnes.blogspot.com/2009/03/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc.html diakses pada tanggal 9 Nopember 2013 pukul 16.46 WIB.
Soal Latihan
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan HPLC!
2. Jelaskan prinsip kerja HPLC dan gambarkan bagan dari susunan alat HPLC !
3. Sebutkan aplikasi dari HPLC dalam kehidupan sehari-hari beserta kegunaannya!
Jawab :
1. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), dalam bidang kefarmasian yaitu HPLC Method for the Analysis of Paracetamol, Cafeine and Dipyrone (Metode HPLC Untuk Analisis Parasetamol, Kafein dan Antalgin).
HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair – cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.
2. Prinsip Kerja Dari HPLC
Prinsip kerja dari HPLC adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
Bagan susunan alat HPLC
3. a. Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
1) HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2) Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4) Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
b. Kegunaan HPLC
Kegunaan umum HPLC adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. HPLC merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.